江南大学陈坚院士、周景文教授：在酿酒酵母中用对香豆酸高效生物合成(2S)-柚皮素

研究背景

      (2S)-柚皮素是一种典型的(2S)-黄酮类物质，具有抗炎、抗氧化和降血脂等功效。但这类物质化学结构复杂，只能从天然植物中进行提取。因此，黄酮类化合物的微生物合成得到了广泛的关注。而如何将芳香族氨基酸有效地转化为苯丙烷，是D-葡萄糖生产(2S)-柚皮素的关键因素。 

      本研究以葡萄糖和对香豆酸构建了生物合成途径。在工程菌株中过表达抗反馈抑制3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合酶(ARO4K229L)，分支酸突变酶(ARO7G141S)和水飞蓟素的查尔酮合酶(SmCHS2)后，(2S)-柚皮素的效价可达到648.63 mg / L，产率为15.6％。还验证了另外两个限制因素：莽草酸途径的反馈调节和查尔酮合酶活性的低下。

研究方法

       首先将水飞蓟草的SmCHS基因亚克隆到pMD19T-Simple中，得到pMD-T-SmCHS基因。选择对细胞生长没有明显干扰的基因位点。trp1-289是对(2S)-柚皮素合成有潜在优势的整合位点。而PDC5和ARO10基因位点可以减少竞争而有利于(2S)-柚皮素的生物合成。删除GAL80基因以消除基因表达对半乳糖诱导的依赖性。

      以酿酒酵母CEN.PK2-1D中的PDC5(丙酮酸脱羧酶)，TRP1(磷酸核糖基氨基磺酸异戊酸酶)，GAL80和ARO10(苯基丙酮酸脱羧酶)作为(2S)-柚皮素途径基因整合位点，将质粒pMD-T101，pMD-T102，pMD-T113，pMD-T123和pMD-T133插入CEN.PK2-1D菌株。

      后又将Pf_pdc5 / Pr_pdc5，Pf_trp1 / Pr_trp1和Pf_gal80 / Pr_gal80D质粒插入CEN.PK2-1D中获得Y100菌株。将ARO4fbr和ARO7fbr插入Y100获得Y200菌株。将过表达异源基因质粒pRS201-pRS207引入Y200，得到Y201-Y207基因，进行酵母菌株的培养。随后以D-葡萄糖为原料进行流加发酵，发酵过程中添加对香豆酸，将酵母重组菌株接种到生物反应器中以优化(2S)-柚皮素的合成。

      研究结果

      酿酒酵母Y100菌株具有葡萄糖合成(2S)-柚皮素的完整途径，(2S)-柚皮素产量为12.63 mg / L。而Y200菌株的(2S)-柚皮素产量可达到25.00 mg / L。在Y200发酵培养基中添加葡萄糖、酪氨酸和对香豆酸后，产量分别提高到22.53、43.24和68.26 mg / L。而且添加对香豆酸组的产量有显著增加。对香豆酸转化为(2S)-柚皮素涉及到三个基因。而在限制因素的验证实验中，产量最高的是Y207，为277.26 mg / L。Pc4CL或MsCHI的过表达对（2S）-柚皮素产生的变化很小，而FjTAL的过表达反而降低了(2S)-柚皮素的产生。综上，菌株Y207具有优异的生长特性，细胞密度性较高。

研究结论

       本研究表明，重组酵母有潜力替代从植物中提取黄酮类化合物的方法。本研究将(2S)-柚皮素生物合成途径整合到酿酒酵母中，并验证了限制该途径的因素，即莽草酸途径代谢通量降低和查尔酮合酶活性低下是限制酿酒酵母(2S)-柚皮素生物合成的两个重要因素。廉价的化学物质对香豆酸适于在酿酒酵母中合成(2S)-柚皮素。尽管在(2S)-柚皮素的高水平生产中仍然存在许多问题，但本研究使微生物发酵规模化制备黄酮类化合物更进了一步。