让p-Tau181信号“长”进SERS热点！Biosensors and Bioelectronics：纳米酶-SERS 级联免疫分析，实现人工血清100 fg/mL检测

近日，南京医科大学第二附属医院检验医学中心、南京医科大学附属淮安第一人民医院神经内科、茂名市人民医院检验科等单位，围绕阿尔茨海默病相关蛋白标志物p-Tau181的便携式超灵敏检测需求，提出了一种纳米酶-SERS级联免疫分析平台。该平台的核心思路不是继续把拉曼报告分子固定在传统SERS纳米标签上，而是把“免疫识别”和“拉曼信号生成”拆开：目标p-Tau181被夹心识别后，Au@Ag-Pt纳米酶催化TMB原位氧化，生成可扩散、带正电的TMB+；TMB+随后迁移并富集到带负电的Ag-rich nanoshell单层膜热点中，从而获得强SERS信号。在检测性能方面，该平台使用便携式拉曼光谱仪即可实现p-Tau181的飞克级检测：标准溶液检测限为50fg/mL，人工血清检测限为100 fg/mL。相关研究成果以“Nanozyme-SERS cascade immunoassay: From in-situ generation to signal enhancement of diffusible reporters in hotspots of Ag-rich nanoshell monolayers”为题，发表于《Biosensors and Bioelectronics》（312, 2026, 119089；DOI: 10.1016/j.bios.2026.119089）。

背景介绍

     阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）是最常见的痴呆类型之一。随着人口老龄化加速，AD的早期识别和长期监测需求日益突出。p-Tau181是AD相关病理变化的重要蛋白标志物之一，在区分AD与其他类型痴呆方面具有较高特异性，因此被广泛关注。传统AD相关检测常依赖脑脊液分析或PET影像。脑脊液采集具有侵入性，PET成本高、设备要求高，这些因素都限制了其在大规模筛查和长期动态监测中的使用。近年来，血液p-Tau181检测受到重视，Simoa等超灵敏免疫分析技术已能将检测能力推进到飞摩尔水平，但仪器和专用试剂成本较高，不利于更广泛的基层或即时检测应用。SERS免疫分析具有灵敏度高、谱学指纹明确和读数速度快等优势，理论上适合蛋白标志物的超灵敏检测。但是，常规SERS夹心免疫分析并不只是“把ELISA换成拉曼读数”这么简单。报告分子、纳米标签、抗体层和底部增强基底之间的空间关系，会直接决定信号能否真正进入电磁热点。本文的价值就在于，它没有单纯追求更强的纳米标签，而是重新设计了信号生成与热点增强之间的耦合方式。

主要内容

常规SERS 夹心免疫分析的两难：信号衰减与假阳性

     传统SERS免疫分析通常采用类似ELISA 的夹心结构：目标抗原先被捕获抗体固定在基底上，再由携带拉曼报告分子的检测纳米标签识别。按照报告分子的固定方式，大致可分为共价固定和静电吸附两类。共价固定的优点是报告分子不容易脱落，但问题在于抗体-抗原-抗体夹心结构会形成明显的蛋白空间阻隔。也就是说，报告分子虽然在纳米标签上，但它距离底部Ag-rich NS 单层膜中最强的电磁热点较远，无法充分利用底物增强能力，最终信号主要依赖纳米标签自身增强，低丰度靶标检测容易受限。静电吸附报告分子则走向另一种风险：报告分子虽然更容易靠近热点，但也更容易从纳米标签表面脱附。当底部SERS基底经过捕获抗体和BSA 修饰后仍保持负电性时，带正电的报告分子可能在没有抗原识别的情况下迁移到底部基底热点中，产生与靶标无关的强信号，导致假阳性背景。

图1 常规报告分子标记型SERS免疫分析与本文纳米酶-SERS级联策略的对比。共价固定报告分子容易受到蛋白层空间阻隔，静电吸附报告分子可能产生脱附和假阳性；本文通过纳米酶原位生成TMB+，使拉曼活性分子在靶标识别后再进入底部热点。

纳米酶-SERS 级联：把“信号生成”从免疫复合物中解耦

     为解决上述问题，研究团队设计了一个“先免疫识别、再原位产生活性报告分子、最后进入热点增强”的级联过程。平台由两部分组成：一是捕获抗体修饰的Ag-rich nanoshell单层膜，作为SERS 活性免疫基底；二是检测抗体修饰的Au@Ag-Pt纳米酶，作为兼具识别和催化功能的探针。当样本中存在p-Tau181时，目标蛋白会被固定在Ag-rich NS单层膜上的捕获抗体识别，再结合Au@Ag-Pt纳米酶探针，形成夹心免疫复合物。随后加入TMB和H2O2，纳米酶催化TMB氧化生成带正电、可扩散的TMB+。由于Ag-rich NS单层膜在抗体和BSA 修饰后仍保持负电性，TMB+可以通过静电作用富集到单层膜热点中，从而实现强SERS读数。这个设计的关键不在于把某一种标签做得更亮，而在于让小分子报告物绕过厚重的蛋白层，直接进入底部增强基底的热点区域。换句话说，免疫复合物只负责决定“是否生成信号”，而真正被增强的拉曼分子是在识别之后原位生成并扩散到热点中的TMB+。

Ag-rich nanoshell单层膜：为便携式拉曼准备均一热点

     底部SERS基底是该平台能否工作的基础。研究团队首先以100-200nm银纳米颗粒为牺牲模板，通过对苯二酚辅助的置换反应制备Ag-rich nanoshell。随后，利用SH-PEG和SH-PS双配体介导的自组装策略，在硅片上形成致密有序的二维单层膜。在结构表征中，Ag-rich NS显示出良好的单分散性，HAADF-STEM和元素分布结果证实Au与Ag在纳米壳中分布。组装后的单层膜呈现紧密排列的六方结构，这对便携式拉曼读数尤其重要，因为便携设备通常难以像台式共聚焦拉曼那样依赖复杂光路和高精度扫描来弥补基底不均一。

图2 Ag-rich NS 单层膜的制备与结构表征。作者通过双配体介导自组装获得致密单层膜，并利用TEM、HAADF-STEM/EDS、SEM和光谱表征证明其结构与光学性质。

     为了筛选最优基底，作者比较了由不同粒径模板得到的Ag-rich-1至Ag-rich-6单层膜，并结合785nm激发下的电磁场模拟和4-MBA 实测SERS 信号进行评估。结果显示，由约140 nm模板得到的Ag-rich-3具有最强增强效果，因此被选为后续检测基底。

图3 不同尺寸Ag-rich NS 单层膜的电磁场模拟与实验验证。Ag-rich-3在785 nm激发下显示出更优的热点增强能力。

     进一步性能评估表明，Ag-rich-3单层膜对4-MBA的最低可检测浓度达到1×10-8M，增强因子约为1.15×1010；在1×10-8M至1×10-4M范围内，1078cm-1峰强与浓度对数呈良好线性关系，R2为0.990。空间均一性和批间重复性方面，作者在7 mm×7mm基底上进行49个区域映射，并在5批独立基底中比较信号，RSD低于3%，说明该基底具备后续定量检测的基础。

图4 Ag-rich-3 NS 单层膜的SERS 性能。该基底表现出较高增强因子、良好线性、空间均一性和批间重复性。

Au@Ag-Pt纳米酶：把p-Tau181识别转化为TMB+生成

     检测探针方面，研究团队采用Au@Ag-Pt纳米酶。制备过程中，先获得约50 nm的Au纳米颗粒，再通过Ag+还原形成Au@Ag核壳结构，最后利用H2PtCl6进行置换反应，形成Ag-Pt合金壳层。TEM 和HAADF-STEM/EDS结果显示，该纳米酶具有Au核和连续的Ag-Pt壳层。催化性能验证中，Au@Ag-Pt纳米酶能够催化TMB 氧化，产生370 nm和652 nm的特征吸收峰，酸终止后转化为450 nm吸收峰。与Au纳米颗粒和Au@Ag纳米颗粒相比，Au@Ag-Pt的类过氧化物酶活性更强，说明Pt位点引入后可显著提升催化效率。抗体功能化方面，高盐稳定性实验提示pH5是制备检测抗体偶联纳米酶的合适条件。抗体修饰后，纳米颗粒水合粒径由79 nm增至92 nm，Zeta电位由-37 mV变为-13 mV，支持anti-p-Tau181成功固定。对于捕获抗体修饰的Ag-rich NS单层膜，作者通过类似ELISA的显色反应进行验证，并最终选择15 μg/mL作为捕获抗体修饰浓度。

图5 Au@Ag-Pt 纳米酶及抗体功能化表征。Au@Ag-Pt 兼具纳米结构、类过氧化物酶活性和抗体偶联能力，是实现TMB+ 原位生成的关键探针。

p-Tau181检测性能：标准液50 fg/mL，人工血清100 fg/mL

     在p-Tau181检测中，平台采用三步夹心免疫流程：p-Tau181样本先与捕获抗体修饰的Ag-rich NS单层膜孵育，洗涤后加入检测抗体修饰的Au@Ag-Pt纳米酶探针，再加入TMB/H2O2进行催化反应，最后用便携式拉曼光谱仪采集信号。TMB+的特征Raman 峰包括1186 cm-1、1332 cm-1和1603 cm-1，其中1603cm-1峰被用于p-Tau181定量。标准溶液检测中，1603 cm-1峰强随p-Tau181浓度降低而下降，在50 fg/mL至1 ng/mL范围内与浓度对数呈线性关系，回归方程为y=3153.3·lg[x]-2212.9，R2为0.990，检测限达到50 fg/mL。与传统报告分子标记策略相比，TMB+原位生成策略在低浓度区间表现出更好的阳性/空白区分度。在1ng/mLp-Tau181条件下，TMB+策略的信号空白比（S/B）达到9.41，而4-ATP、4-MBA、NBA和R6G等传统报告分子标记方法的S/B仅为0.72-1.75；在1pg/mL条件下，常规标记体系几乎接近空白，而TMB+策略仍可维持明显区分。

     在人工血清加标样本中，平台仍能获得浓度依赖性SERS响应，1603 cm-1峰强与p-Tau181浓度对数保持较好线性，R2为0.987，检测限为100fg/mL。不过，人工血清中的信号强度低于标准溶液，作者认为这可能与白蛋白、球蛋白等血清蛋白的非特异吸附有关。因此，文章进一步采用人工血清基质匹配校准，并通过加标回收实验验证，回收率为84.6%-102.7%，RSD低于10%。

图6 纳米酶-SERS级联平台用于p-Tau181检测。TMB+在靶标识别后原位生成并进入Ag-richNS热点，实现标准溶液和人工血清中的飞克级检测。

小结

    该研究提出了一种清晰的纳米酶-SERS级联策略：用Au@Ag-Pt纳米酶负责催化产生活性Raman报告分子，用Ag-rich NS单层膜负责提供均一而强的电磁热点，再用便携式拉曼光谱仪实现读数。其核心创新不是单点材料性能，而是把信号生成位置、信号增强位置和免疫识别过程重新拆分并耦合起来。从应用角度看，p-Tau181是AD相关血液标志物研究中的重要靶标。该平台在人工血清中达到100 fg/mL检测限，说明其在低丰度蛋白检测方面具有潜力。同时，基底均一性、批间重复性、基质匹配校准和便携式拉曼读数也使这项工作不只是材料概念验证，而是向可用检测流程迈进了一步。