单核细胞增生性李斯特杆菌是一种具有强病原性的食源性细菌，通过肠道引起感染。肠道菌群在抵抗微生物感染方面的作用受到很少关注。本实验使用管饲法，在8周大的小鼠中接种野生型李斯特杆菌EGD-e，并进行了粪便微生物群移植（FMT）。结果发现，感染小鼠的肠道菌群在24小时内发生了快速的变化，丰富度和多样性有所增加。其中，厚壁菌门的数量减少，拟杆菌门、拟青霉门和乳球菌科的数量明显增加。此外，在感染后第3天，粪球菌、布鲁氏菌和真细菌的数量也有所增加。通过从健康小鼠中移植的粪源微生物降低了感染小鼠的死亡率约32%。与磷酸缓冲液（PBS）处理相比，粪便微生物群移植处理减少了宿主细胞TNFα、IFN-γ、IL-1β和IL-6的产生。总之，粪便微生物群移植具有治疗李斯特杆菌感染的潜力，并可用于细菌耐药性管理。

单核细胞增生性李斯特杆菌是一种食源性病原体，可导致严重的李斯特菌感染，其死亡率为20%~40%。大多数感染发生在免疫受损的宿主中，如孕妇、老年人和其他高危人群。李斯特杆菌通常通过受污染的食物进入人体胃肠道，然后侵入上皮细胞，在穿过肠壁之前持续存在和繁殖。李斯特杆菌的黏附蛋白（LAP）被认为可以通过调节中央核因子-κB（NF-κB）和肌球蛋白轻链激酶（MLCK）通路来打开肠上皮的紧密连接，从而导致李斯特杆菌在感染早期穿过肠壁。李斯特杆菌的侵染蛋白InlA可诱导细菌重组并帮助其通过肠壁转移。因此，李斯特杆菌在胃肠道内的黏附是感染宿主的关键步骤。当健康人摄入少量的李斯特杆菌时，细菌很难侵入宿主细胞。小鼠口服李斯特杆菌的致死剂量可高达5 × 10⁹ CFU，而静脉接种剂量为4 × 10⁴ CFU。肠道菌群被认为能够通过阻止致病菌的定植来影响它们对宿主的感染。

Zachar等使用管饲法将李斯特杆菌接种至无特定病原体（SPF）和无菌小鼠，并发现无特定病原体小鼠未发病（即使剂量达到5 × 10⁷ CFU）。相比之下，无菌小鼠在接种剂量为100 CFU时即出现腹泻、皮毛斑驳和体重下降症状，并在感染后的第5天死亡。最近的研究也证明了肠道菌群平衡在抵抗致病菌感染中的重要作用，但其具体机制仍不清楚，尽管已知肠道菌群失调会破坏肠道屏障并促进TLR4/TNF-α信号通路的激活。

高通量测序技术可以揭示复杂微生物群落的组成。目前的研究使用这一技术来检测饲喂EGD-e后BALB/c小鼠的肠道菌群组成，并评估李斯特杆菌感染的不同时间点微生物群落的变化，以揭示肠道菌群对李斯特杆菌感染的抵抗力。通过从健康小鼠中移植的粪便微生物群来治疗感染小鼠，演示了粪便微生物群移植治疗李斯特杆菌感染的潜力，并对肠道菌群和病原体之间的关系做出了解释。

宿主发病率和组织学检查

EGD-e感染的小鼠在接种后的第2天开始死亡。在接种不同剂量的EGD-e后，存活率如下：5×10¹⁰ CFU：100%；7×10¹⁰ CFU：80%；1×10¹¹ CFU：40%；1.5×10¹¹ CFU：30%；2×10¹¹ CFU：0%（图1a）。选择1×10¹¹CFU剂量进行进一步的实验。

在接种后的第1、2、3、4天里，对接种1×10¹¹CFU/只的小鼠的肝脏、脾脏和肠道中的EGD-e进行计数（图1b）。肠道中的EGD-e含量在第1天最高，但在第2天下降了2倍，并在接下来的几天里保持稳定。肝脏计数在第1至第2天之间增加了11倍，在第1至第3天之间增加了10倍，到第4天增加了12倍。在脾脏中也观察到类似的趋势。

在接种后的第3天，处死小鼠并制备肝脏、脾脏和结肠的组织学标本（图1c）。结果显示肝脏组织中有小型脓肿和位于中央动脉附近的细小淋巴鞘。与健康小鼠相比，感染小鼠的结肠呈局灶性黏膜侵蚀和肠绒毛紊乱，而健康小鼠的结肠则有规律地排列着杯状细胞和大小均匀的细胞。

图1  灌胃感染 EGD-e 的小鼠。 (a) 感染不同剂量 EGD-e 的小鼠的存活率。 (b)肝脏、脾脏和肠的EGD-e含量。 *表示P<0.05，**表示P<0.01 (c)灌胃接种EGD-e后肝脏、脾脏和结肠的组织学检查。

肠道菌群的丰富性和多样性

从30个样本中总共生成了1 538 945条序列，经过质量过滤和去除嵌合序列后，每个样本只剩下51 298个读数。占总序列数>0.01%的200个OTUs（S1a）。当读数小于10 000时，稀疏曲线趋于平稳，表明当前测序深度下捕获了大部分样本中的微生物多样性信息（S1b）。各组OTUs的总数在438至476个之间，主要为389个。健康小鼠（476个）的微生物群落多样性高于PBS处理组小鼠（C1：438个，C3：444个）和EGD-e处理组小鼠（C1：438个，C3：444个），而NG组的OTUs含量最高，且其Shannon多样性指数也低于PBS处理组和EGD-e处理组（S1b和S1c）。

肠道菌群的组成

健康小鼠的肠道菌群主要由厚壁菌门（55.58%）、拟杆菌门（37.39%）、变形菌门（5.08%）和除铁菌门（1.09%）组成。与对照组相比，EGD-e处理组在第1天的变形菌门数量减少，而在第3天增加（图2a）。与对照组相比，磷酸缓冲液处理组的杆菌和碘杆菌数量显著增加（S2a）。与对照组相比，EGD-e处理组的乳酸杆菌数量减少，特别是在第1天（图2b）。与对照组相比，E1组（EGD-e处理组）的Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcaceae_UCG-010、family_XIII_AD3011、厌氧菌、Bacteroidales_S24-7_group和Prevotellaceae_UCG-001数量增加（P < 0.05），E3组的Rikenellaceae_RC9_gut_group、球杆菌、副杆菌、葡萄球菌、真杆菌、厌氧菌、原球菌和幽门螺杆菌数量增加（P < 0.05）。E3组中的Prevotellaceae_UCG-001和Bacteroidales_S24-7_group的含量有所下降（S2b）。

图2 门 (a) 和属 (b) 水平的粪便细菌群落。（a，b）粪便中细菌群的相对丰度。 丰度<1%的门或属与其他门或属合并。 NG：健康小鼠（n = 5）； C：包括C1和C3，小鼠（n = 5）在接种后第1天或第3天用磷酸缓冲液灌胃； E：包括E1和E3，小鼠（n = 5）在接种后第1天或第3天用EGD-e灌胃。

粪菌移植后的宿主体重和死亡率

所有感染EGD-e的小鼠在前两天内体重迅速下降，相较于低浓度组和E磷酸缓冲液处理组，高浓度组小鼠的体重下降较缓慢。低浓度组小鼠的体重在前2天持续下降，直到第6天开始回升，而磷酸缓冲液处理组的小鼠在前8天都有体重下降 (图3a)。其中，低浓度处理组有6只小鼠在第3天死亡，另外4只小鼠在第4天死亡；磷酸缓冲液处理组有3只小鼠在第3天死亡，另外4只小鼠在第4天死亡。而高浓度组在第3天没有小鼠死亡，只有2只小鼠在第4天死亡。与其他组相比，高浓度组的存活率显著提高。存活率分别为高浓度：76%，低浓度组：56%，磷酸缓冲液处理组为44% (图3b)。

图3 粪菌移植治疗后感染 EGD-e 的小鼠的体重和存活率。 (a)体重变化。 (b) 存活率。步骤1：通过灌胃感染EGD-e的小鼠。 步骤 2：用粪源菌和磷酸缓冲液处理受感染的小鼠。 步骤 3：终止处理。 EGD-e + FMT-H：高浓度粪便浆液（1.1 g/只）； EGDe + FMT-L：低浓度粪便浆液（0.55 g/只）， EGD-e + PBS：PBS； F：用粪便浆液处理的健康小鼠； C：用于提供新鲜粪便的健康小鼠。结果来自3 次独立重复。

粪菌移植后的肠道菌群丰富性和多样性

粪菌移植治疗后的第1天，与磷酸缓冲液处理组相比，两个处理组小鼠的李斯特菌和拟杆菌数量显著降低，而玫瑰菌、Family_XIII_UCG-001和红球菌的数量显著增加。到第3天，与磷酸缓冲液处理组比较，粪菌移植组的甲螺旋菌、Prevotellaceae_UCG-001和Ruminiclostridium_5数量有所增加，到第7天，其杆菌、乳酸杆菌、糖母单胞菌、Ruminoccoccaceae_UCG-005和辅前列腺素寡烯的数量也有所增加。C组和F组出现了厌氧杆菌和乳酸杆菌（图5和6）。

图5 属水平的粪便细菌群落。3组粪便中细菌群的相对丰度。丰度不到1%的属被合并到其他属中。“H”代表高浓度组，“L”代表低浓度组，“P”代表磷酸缓冲液处理组。

图6 线性判别分析效应大小（LEfSe）中多级物种差异的判别分析。首先采用非参数阶乘Kruskal Wallis (kw)和秩检验检测丰度差异显着的特征，找出丰度差异显着的群体。 最后利用线性判别分析（LDA）估计各组丰度对差异效应的影响。 不同颜色节点代表相应组内显着富集且对组间差异有显着影响的微生物类群；浅黄色节点代表不同组间差异不显着或对组间差异无显着影响的微生物类群。“H”代表高浓度组，“L”代表低浓度组，“P”代表磷酸缓冲液处理组。

粪菌移植后的宿主组织学检查和细胞因子表达

对粪菌移植后的小鼠肝脏进行了组织学检查。与感染小鼠肝脏相比，粪菌移植治疗后小鼠肝脏组织中的微小脓肿减少（图7a和b）。随后检测了肝脏中TNFα、IL-10、IFN-γ、IL-4、IL-1β和IL-6的表达水平。与健康小鼠相比，磷酸缓冲液处理组小鼠肝脏中的TNFα、IL-10、IFN-γ、IL-1β和IL-6分别增加了182.1倍、687.5倍、249.9倍、40.7倍和163.6倍；相较于磷酸缓冲液处理组小鼠，高浓度处理组小鼠的肝脏中TNFα、IL-10、IL-1β和IL-6的表达分别降低了57.9%、91.3%、66.6%和95.9%（P < 0.05，P < 0.001，无显著差异，P < 0.01）。在第3天和第7天，高浓度处理组小鼠的肝脏中观察到与第1天类似的变化情况。IL-4的表达在第1天和第3天均无明显变化，在第7天略有增加。综上所述，粪菌移植通过抑制TNFα、IL-10、IFN-γ、IL-1β和IL-6的表达，改善肠道微生物生态失调，减轻肝脏炎症反应（图7c）。

图7 粪菌移植后宿主组织学检查和细胞因子表达。(a)灌胃移植EGD-e 后小鼠肝脏的组织学检查。 (b) 粪菌移植后小鼠肝脏的组织学检查。 (c) 粪菌移植后肝脏细胞因子 mRNA 的产生。 “H”代表高浓度组，“L”代表低浓度组，“P”代表磷酸缓冲液处理组。1d表示粪菌移植后的第一天。 将每个基因的 mRNA 表达水平标准化为 GAPDH 的表达水平。 RT-PCR结果采用2-ΔΔCT法进行计算和定量分析，其中ΔCT为主要CT（靶基因）-CT（GAPDH基因），-ΔΔCT为主要[ΔCT（感染组）ΔCT（C组） ]。 纵坐标值代表治疗组小鼠细胞因子转录水平与健康小鼠细胞因子转录水平的多重关系。 条码代表三个重复的平均值±标准误差。 * 表示 P < 0.05，** 表示 P < 0.01，*** 表示  P < 0.001。

已有研究表明，肠道微生物群对于防止致病菌感染如单核细胞增生李斯特氏菌和肠道沙门菌具有保护作用，可能是通过抗性定植或诱导免疫反应的机制实现的。然而，在以往的研究中，还没有将粪源微生物移植应用于经口腔感染单核细胞增生李斯特氏菌的SPF级实验动物。

实验结果显示，感染小鼠在接种后的第1天肠道中的EGD-e含量最高，第3天肝脏和脾脏的含量也有所增加。小鼠在感染后的48-72小时内死亡，但一周后存活的小鼠开始恢复，经过两周恢复正常。即使仅使用磷酸缓冲液处理，小鼠的肠道微生物丰富度和多样性在接种后的24小时内也发生了显著变化。对照组在接种前一次性进行的磷酸缓冲液处理后，发现在第3天小鼠的肠道微生物组成与第1天相似，而与预处理后的结果不同。这些结果与之前的研究一致，表明肠道微生物群对外部环境的变化具有快速反应能力，尽管对微生物群的恢复方面的研究相对较少。对照组在接种前进行的一次性PBS处理后，第3天的肠道微生物组成与第1天相似，而不是与处理前相似。这一发现与以往的研究结果一致，说明肠道微生物群能够对外部环境的变化做出快速反应，但尚缺乏对微生物群恢复的研究。与对照组相比，磷酸缓冲液处理组的脱硫弧菌科、Alistipes和Odoribacter显著增加，乳酸杆菌显著减少。最近的研究发现，碘杆菌和厌氧杆菌在高脂肪饮食的小鼠体内产生硫酚（SLs），这可能是一种细菌代谢物的潜在标志物。磷酸缓冲液处理组和EGD-e处理组均表现出乳酸菌减少的趋势，其中EGD-e处理组减少更为显著，这表明EGD-e感染对乳酸菌减少起到独立作用。脂甾醇溶菌素S（LLS）是李斯特菌中产生的一种细菌素，已经被证明能够杀死其他种类的靶细菌，如德尔布鲁氏乳杆菌亚属。乳酸杆菌和金黄色葡萄球菌之间可能存在与李斯特菌的竞争关系。因此，LLS可能通过改变宿主肠道微生物群的组成，促进李斯特菌的定植和侵染。李斯特菌与宿主微生物群之间的相互作用值得进一步研究。

在病原体侵入的情况下，肠道微生物的稳定和健康对于宿主的保护作用已被证实。年龄增长、免疫缺陷或妊娠等因素会导致肠道菌群结构的改变，从而导致生态平衡失调，进而促进李斯特菌的侵染。在接种EGD-e后的4天内，可以在小鼠体内检测到李斯特菌的存在。接种后的第1天，EGD-e处理导致厚壁菌门减少，拟杆菌门、拟杆菌菌门和乳球菌科增加。与此同时，Prevotellaceae_UCG-001、Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcaceae_UCG-010、family_XIII_AD3011和厌氧菌数量在第1天升高，到第3天下降。推测乳酸杆菌通过代谢未完全发酵的底物引发急性肠炎。

因此，致病菌可能通过操纵宿主的炎症反应来促进其在肠道中的生长。此外，肠道炎症的特征是专性厌氧菌的减少和兼性厌氧菌的增加，如变形菌门和梭菌纲的细菌。此外，厌氧菌是一种易感致病菌，可引起多种宿主免疫反应，并在接种后的第1天明显增加。变形杆菌门、拟杆菌门和蓝藻菌门在第3天增加更为明显，可能引发炎症。有益的益生菌如益生菌、粪球菌、真菌菌和真细菌在第3天也有增加。布鲁氏菌已被证明有助于小鼠从霍乱弧菌感染中恢复。

巨噬细胞感染Lm会产生促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6，进而激活巨噬细胞和中性粒细胞产生杀伤李斯特菌的分子如一氧化氮。过量产生的促炎细胞因子可能导致肝脏和脾脏的细胞损伤。在感染后的第2天，TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6的表达显著增加，表明细菌负荷和炎症反应增加，导致小鼠在第3天死亡。与磷酸缓冲液处理组相比，粪菌移植处理组的TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6水平降低。粪菌移植降低了Lm在肠道中的总体负荷，抑制了其全身扩散，并降低了免疫激活效应。

目前的研究结果支持将粪菌移植作为治疗李斯特菌感染的一种方式，但其机制仍需进一步探究。粪菌移植可能通过调节宿主的免疫反应来抑制李斯特菌的生长，但对于其是否对李斯特菌具有进一步的抑制作用尚不清楚。非瑟酮是一种天然的类黄酮，它与LLO的2环和3环部分结合，能够抑制李斯特菌的溶血活性，从而减少其对组织和细胞的感染。查尔酮可通过阻断李斯特菌中酶排序酶A (Srt A)的活性位点，抑制李斯特菌对小鼠细胞的侵染并降低其致病性。表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG) 也已被证明可以与Srt A和肺炎链球菌溶血素(PLY) 结合，从而降低肺炎链球菌的毒性。因此，粪源移植可能涉及类似的机制来治疗李斯特菌感染。

综上所述，李斯特菌感染和随后宿主死亡是一系列非常迅速的过程。在这些过程中，宿主体内的微生物区系发生了巨大的变化。目前的研究结果表明，李斯特菌在24小时内打破了肠道微生物平衡，导致条件致病菌和相关促炎细菌数量大量增加，同时降低了益生菌菌株（如乳酸杆菌）的水平。然而，具有潜在益生作用的菌株，如布劳蒂亚菌，接种后第3天数量增加，尽管具有引发炎症反应的条件致病菌和相关细菌的数量并没有减少。尽管这些潜在的益生菌对于李斯特菌保护作用的机制尚不清楚，但作者相信它们解释了部分小鼠在李斯特菌感染中存活的能力。乳酸杆菌通过调节IFN刺激基因(ISGs)的表达和增加microRNA-192的表达抑制了小鼠肠道中李斯特菌的全身扩散。乳酸菌还显著提高了单核增生乳杆菌基因的转录水平，该基因使其能够利用肠道中的碳氮源。来自屎肠球菌的一种细菌膜蛋白（BGPAS1-3）能够防止李斯特菌 ATCC 19111感染后异化的Caco-2单层中紧密连接的破坏，并诱导李斯特菌宿主抗性反应，促进肠上皮细胞产生保护性物质TGFβ。来自健康小鼠的肠道菌群抑制了促炎细胞因子的表达，并减少了肝脏和脾脏的损伤。