中国农科院作科所利用基因编辑创制高直链淀粉玉米

玉米作为全球广泛种植的作物，其淀粉不仅为人类和动物提供了重要的能量和营养来源，更因其独特的品质特性，在食品和制药工业中扮演着关键角色。特别是高直链淀粉含量的玉米淀粉，因其卓越的品质而备受青睐。直链淀粉含量的高低直接影响淀粉的质地和用途，而与直链淀粉含量密切相关的抗性淀粉，作为一种宝贵的膳食纤维，已被证实对于促进肠道健康、控制血糖水平和减少胰岛素反应具有显著益处。随着消费者对健康食品需求的不断增长，富含抗性淀粉的食品逐渐成为市场的新宠。然而，传统玉米品种中抗性淀粉的含量通常较低，限制了其在健康食品领域的应用。

中国农业科学院作物科学研究所的科学家们在《The Crop Journal》上发表了一篇突破性研究论文，题为“通过CRISPR/Cas9介导的淀粉分支酶编辑提高玉米中的高直链淀粉和抗性淀粉含量”。在这项创新性研究中，研究人员巧妙地运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，精确地对玉米淀粉合成途径中的关键基因SBEI和SBEIIb进行定点编辑，成功培育出了含有更高直链淀粉和抗性淀粉的新型玉米种质。这一成果不仅为改良玉米淀粉品质提供了新的策略，也为满足市场对健康食品成分的需求开辟了新的道路。

利用农杆菌转化KN5585幼胚后，研究者在T0代植株中发现了多种sbeI和sbeIIb突变。随后，重点研究了三个编辑事件：E1、E2和E12（图1）。E1的两个sbeI等位基因由于插入一个核苷酸而产生移码突变，而两个SBEIIb等位基因与KN5585野生型（WT）相同。E1的sbeI基因预测会产生一个截短的包括344个氨基酸的蛋白，但是缺乏SBEI的关键催化结构域。E2的两个sbeIIb等位基因由于缺失了四个核苷酸而产生了移码突变，而两个SBEI等位基因与WT相同。E2的sbeIIb基因预测会产生一个截短的包括270个氨基酸的蛋白，但是缺乏SBEIIb的关键催化结构域。E12的sbeI和sbeIIb都发生了突变，其基因型分别与E1的sbeI和E2的sbeIIb相同（图1）。

通过自交繁殖，研究者获得了不含转基因成份的T3代植株。sbeI和sbeIIb突变显著影响玉米籽粒。与WT相比，sbeIIb突变导致籽粒变小，而sbeI突变增强了sbeIIb突变的作用。E2和E12的粒长和粒宽较WT显著减少。此外，E1、E2和E12的平均百粒重也较WT显著降低。玉米植株也受到sbeI和sbeIIb的显著影响。E1、E2和E12植株在苗期的生长速度比WT慢，这可能是由于sbeI和sbeIIb活性丧失导致淀粉利用效率低。在成熟期，与WT相比，E1的株高降低了，但差异并不显著；E2和E12的株高显著降低（图1）。

图1 利用CRISPR/Cas9系统创制SBEI和SBEIIb突变体

研究者利用WT、E1、E2和E12纯化淀粉分析了直链淀粉含量（AAC）和抗性淀粉含量（RSC）。WT、E1、E2和E12的平均AAC分别为31.63%、30.95%、53.48%和48.21%（图2）。WT、E1、E2和E12的平均RSC分别为0.19%、1.07%、26.93%和34.04%。E1的RSC显著高于WT。该结果表明，SBEI活性丧失显著提高了RSC。此外，E2的RSC显著高于WT，表明SBEIIb活性丧失显著增加了RSC。WT淀粉颗粒具有不规则和多边形形状，E1淀粉颗粒与WT之间没有显著差异，而E2淀粉颗粒更不规则，没有明显的边缘（图2）。E1和WT淀粉含有典型的A型晶体结构。E2和E12淀粉含有典型的B型晶体结构。E1淀粉的糊化特性类似于WT。E2淀粉的ΔH低于WT，但T0、Tp和Tc都显著高于WT。该结果与AAC结果一致，即增加抗性淀粉会降低淀粉的结晶度，淀粉颗粒表面的直链淀粉会阻碍颗粒内支链淀粉的糊化。

1. 基因编辑成功提高淀粉品质：通过CRISPR/Cas9系统对玉米中的淀粉分支酶I（SBEI）和淀粉分支酶IIb（SBEIIb）进行基因编辑，成功地提高了玉米淀粉的直链淀粉含量（AC）和抗性淀粉含量（RSC）。
2. E1突变体特征：
• SBEI基因发生移码突变，导致植物的RSC提高到1.07%。
• 百粒重（HKW）和植株高度（PH）相比野生型（WT）有所降低。
• 淀粉颗粒形态与WT相似，但具有较低的AC。
3. E2突变体特征：
• SBEIIb基因发生移码突变，导致AC显著提高到53.48%，RSC提高到26.93%。
• 淀粉颗粒形态、大小和分布与WT有显著差异，颗粒形状更不规则，尺寸变小。
• 淀粉具有B型晶体结构，与高直链淀粉的典型结构相符。
4. E12突变体特征：
• 同时含有SBEI和SBEIIb的移码突变，展现出协同效应，RSC最高，达到34.04%。
• 百粒重和植株高度进一步降低，淀粉颗粒尺寸减小。
5. 淀粉理化性质分析：
• E2和E12突变体的淀粉显示出与WT不同的链长分布（CLD）模式，长链支链淀粉（amylopectin）含量增加，这可能有助于形成更稳定的晶体结构，从而提高RSC。
• X射线衍射分析显示E1和WT淀粉具有A型晶体结构，而E2和E12淀粉转变为B型晶体结构，这通常与高直链淀粉相关。
6. 热特性分析：
• E1淀粉的热特性与WT相似，但E2淀粉的糊化焓（DH）低于WT，且其糊化温度（To、Tp、Tc）高于WT，表明淀粉的结晶度降低，颗粒表面直链淀粉阻碍了颗粒内支链淀粉的糊化。
7. 基因表达分析：
• SBEI和SBEIIb的突变显著影响了淀粉生物合成相关基因的表达模式，如SBEIIa、SS1、SSIIa、SSIIIa和SSIIIb在E12胚乳中上调表达，表明SBEI和SBEIIb之间可能存在协同效应。
8. 研究意义：
• 这项研究不仅提高了对玉米淀粉合成途径的理解，而且为通过基因编辑技术改良作物品质提供了实际应用案例。
• 通过精确的基因编辑，可以快速改良玉米品种，提高其在食品和制药工业中的应用价值。