北京工商大学刘新旗教授等：大豆蛋白和大豆肽对小鼠焦虑样行为的作用研究

北京工商大学食品与健康学院/国家大豆加工产业技术创新中心/北京食品营养与人类健康高精尖创新中心/北京市食品添加剂工程技术研究中心的李雯晖、王敏、李赫、王俊茹、奚宇和刘新旗为研究大豆蛋白和大豆肽对慢性不可预测轻度应激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)诱导的小鼠焦虑样行为的影响,选用40只6～7周龄雄性C57BL/6J小鼠,随机分为空白组、模型组、大豆蛋白组和大豆肽组。通过CUMS诱导小鼠产生焦虑样行为,并在第53天进行高架十字迷宫实验,第54天收集脑组织样本检测小胶质细胞的激活情况、炎症因子和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的水平,以及BDNF-TrkB-CREB通路上相关蛋白的表达。结果表明:与空白组相比,CUMS可使小鼠在开臂中的时间和进入开臂的次数占比显著降低,Iba-1阳性细胞数量显著增加,IL-1β水平显著上升,BDNF、p-TrkB、p-CREB表达显著下降(P<0.05);与模型组相比,大豆蛋白组中小鼠进入开臂的次数占比为模型组的1.4倍,同时IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平分别降低了21.5%、34.2%、10.9%和32.5%,BDNF蛋白表达提高了39.8%(P<0.05)。大豆肽组中小鼠在开臂中的时间和进入开臂的次数分别为模型组的2.0倍和1.4倍,同时小鼠海马区、CA1和CA3区Iba-1阳性细胞数量分别下降了39.0%、43.2%和40.8%,IL-10 水平提高了23.3%,IL-1β和TNF-α水平分别降低了26.8%和13.7%,BDNF水平提高了22.0%,BDNF和p-TrkB蛋白表达分别提高了63.0%和42.5%(P<0.05)。研究结果表明,大豆蛋白和大豆肽营养干预均可缓解神经炎症、增强神经营养功能,从而发挥抗焦虑活性,其中大豆肽效果更佳。研究旨在为抗焦虑食品的研发提供理论参考。

焦虑症是一种普遍而复杂的精神障碍,其核心特征包括过度恐惧、焦虑或对感知威胁的回避行为^[1]。根据世界心理健康调查报告,全世界约1/4的人可能患有或曾经患有焦虑症^[2-3]。焦虑症患者常伴有身心症状,如烦躁易怒、惊恐、失眠多梦、头晕头痛、胃部不适及心血管疾病等^[4]。目前,治疗焦虑症的常规方法主要是药物治疗和心理辅导结合。药物主要有选择性血清素再摄取抑制剂、血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂和单胺氧化酶抑制剂等,但是药物治疗会产生恶心、头痛、困倦、体重增加等多种副作用^[5-6]。通过膳食营养辅助治疗焦虑症不仅更易被患者接受,还能有效避免药物治疗的副作用。

蛋白质和肽在膳食营养中占有重要地位。目前,有关蛋白质水解物和肽抗焦虑活性的研究主要集中于牛奶蛋白,对大豆蛋白及其水解物的研究较少^[7]。大豆蛋白是一种优质蛋白,其营养丰富、氨基酸平衡,具有降血脂、降血糖等多种保健功能^[8]。大豆肽是以大豆蛋白为主要原料,经蛋白酶酶解,再经过分离和精制等特殊处理得到的低聚肽混合物,一般由3～6个氨基酸组成,分子质量低于1000 Da^[9]。大豆肽不仅保留了大豆蛋白的优点,同时还具有易溶解、易吸收、利用率高、稳定性强等理化性质,以及降血压、降血脂、抗疲劳、抗氧化等功能活性^[10-11]。在神经调节方面,大豆吗啡-5(YPFVV)、大豆吗啡-6(YPFVVN)和大豆吗啡-7(YPFVNA)来源于大豆β-球蛋白的β-亚基,在给ddY(deutschland, denken, yoken)小鼠口服后起到了抗焦虑的作用^[12]。大豆十一肽βCGα 323-333(FLSSTEAQQSY),源自大豆β-球蛋白的α亚基,给ddY小鼠口服后也起到了抗焦虑的作用^[13]。然而,对大豆肽通过营养干预发挥抗焦虑作用的研究鲜有报道,同时也缺乏大豆蛋白和大豆肽发挥抗焦虑作用的对比研究。

研究表明,神经炎症参与焦虑的发病机制,与炎症相关的大脑变化已被识别为焦虑症的神经生物标志物^[14-15]。同时,脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)作为神经营养因子家族的重要成员,其在神经元生成、存活和分化中的作用对于调节焦虑和抑郁等疾病具有显著影响^[16]。许多临床和动物实验研究均强调了低水平的BDNF或高水平的炎症标志物与焦虑症和抑郁症发展之间的关联^[16]。本研究通过检测小鼠的行为学表现、小胶质细胞表达、炎症因子、BDNF水平和BDNF-TrkB-CREB通路上相关蛋白的表达,探究大豆蛋白和大豆肽的抗焦虑活性及其潜在机制,旨在为大豆蛋白和大豆肽在预防焦虑症方面的应用提供新的视角,同时为开发相关抗焦虑食品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆蛋白(蛋白质质量分数为84.8%),山东御馨生物科技有限公司;大豆肽由大豆蛋白制备并遵循实验室要求(蛋白质质量分数为90.7%,71.1%的肽段分子质量小于1 000 Da)^[17];AIN-93M标准饲料、大豆蛋白饲料和大豆肽饲料,北京华阜康生物科技股份有限公司;白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和BDNF试剂盒,杭州联科生物技术股份有限公司;放射免疫沉淀(RIPA)裂解缓冲液,北京索莱宝科技有限公司;聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜,美国密理博公司;抗体Iba-1(ab178846)、BDNF(ab108319)、CREB(ab32515)、phospho-CREB(Ser133,ab32096)、TrkB(ab187041),艾博抗(上海)贸易有限公司;山羊抗兔IgG(H+L)HRP二抗(S0001),江苏亲科生物研究中心有限公司;抗体GAPDH(bs-41373R),北京博奥森生物技术有限公司;Tris-HCl缓冲液-吐温20(TBST)、一抗α-Tubulin(AF0001)、辣根过氧化物酶(HRP)-共轭二抗(A0208)和BeyoECL Moon增强化学发光试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

NVL5100B型百分之一天平、EX623ZH型千分之一天平,上海奥豪斯仪器有限公司;IX73型倒置显微镜,日本奥林巴斯公司;WKB-100型微孔板恒温振荡器,上海拓赫机电科技有限公司;Infinite 200 Pro Nanoquant型多功能酶标仪,瑞士帝肯公司;Mini-Protein Tetra型垂直电泳仪、Trans-Blot Turbo型蛋白转印系统、ChemiDoc MP型凝胶成像分析系统,美国伯乐公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大豆蛋白和大豆肽饲料配制

根据前期研究进行不同组的饲料配制^[18]。基于AIN-93M标准的饲料配方,并针对蛋白质成分进行调整以制备大豆蛋白和大豆肽饲料。分别将饲料中的140 g酪蛋白等氮替换为148 g大豆肽和139 g大豆蛋白,其余成分保持不变(胱氨酸1.8 g、玉米淀粉496 g、麦芽糖糊精125 g、蔗糖100 g、纤维素50 g、大豆油40 g、矿物质混合物35 g、维生素混合物10 g、酒石酸氢胆碱2.5 g、抗氧化剂8 g),3种饲料的总能量均为16 116 kJ。

1.3.2 实验动物分组与处理

雄性SPF级C57BL/6J小鼠(6～7周龄),体重(22.1±0.7)g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司。每笼4只小鼠,饲养温度(25±2)℃,相对湿度60%,并采用12 h光/暗周期循环,所有小鼠均可自由进食和饮水。本研究在北京华远时代科技有限公司进行,实验方案经该公司动物伦理委员会批准(动物实验伦理编号HYSD2021-12)。

将小鼠适应性饲养一周后,开始为期52 d的慢性不可预测轻度应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)诱导焦虑建模和饲喂。将小鼠随机分为空白组、模型组、大豆蛋白组和大豆肽组,每组10只。除空白组外,其他组小鼠均进行CUMS造模,空白组和模型组小鼠饲喂AIN-93M标准饲料,大豆蛋白组小鼠饲喂大豆蛋白饲料,大豆肽组小鼠饲喂大豆肽饲料,于第54天解剖小鼠并收集脑组织样本。

1.3.3 CUMS诱导小鼠焦虑模型的建立

CUMS造模参考Li等^[19]的方法并加以修改。每天对小鼠进行两种随机压力应激,并于9:00、14:00和21:00中随机选择2个时间点进行。压力主要有8种,包括约束压力2 h、30 ℃水浴30 min、湿垫料4 h、无垫料4 h、45°笼子倾斜4 h、4 ℃冷水游泳1 min、断食断水12 h以及昼夜颠倒12 h,造模的具体时间安排见表1。

表1 慢性不可预测轻度应激造模方法

“—”表示无任何处理。

1.3.4 高架十字迷宫实验

高架十字迷宫由2个开臂(30 cm×8 cm)和2个闭臂(30 cm×7 cm)组成,侧壁高24 cm,与中央方形平台(7 cm×7 cm)相连;实验装置高50 cm。实验方案参考王维刚等^[20]的方法并略有改动。测试时,将小鼠单独放置在高架十字迷宫的方形平台上,面向闭臂并允许其探索5 min。装置上方固定一台数码相机,用于记录小鼠的行为。

1.3.5 免疫组织化学法检测

使用免疫组织化学法检测小鼠脑组织中Iba-1阳性细胞的数量,以评估小胶质细胞的激活状态。参考Hadizadeh-Bazaz等^[21]的方法并加以修改。使用戊巴比妥钠将小鼠麻醉,并用生理盐水(质量分数为0.9%的NaCl溶液)对小鼠进行心脏灌注,然后用质量分数为4%的多聚甲醛溶液(溶于0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液,pH值为7.4)进行固定。灌注完成后,立即摘取整个大脑并存放在相同的固定液中。对于组织切片的制备,首先对所有样品进行脱蜡和抗原修复处理,然后进行石蜡包埋,制备厚度为4 μm的脑组织切片并存放于4 ℃的环境中。随后进行染色,使用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS,pH值为7.4)清洗切片并在3%的H₂O₂中处理15 min。经PBS再次清洗后,切片在质量分数为5%的牛血清蛋白溶液中封闭30 min。将切片与兔单克隆抗体Iba-1(稀释比例1∶1 000)混合并在4 ℃的环境中孵育过夜。切片经过PBS清洗后,与山羊抗兔IgG(H+L)HRP二抗(1∶200)混合并于室温下孵育1 h。再次清洗后,使用3′-二氨基联苯胺进行染色,待观察到出现棕色后立即终止反应。使用苏木精染色3 min后于倒置显微镜下观察切片,并计算Iba-1阳性细胞的数量。

1.3.6 炎症因子及脑源性神经营养因子的测定

使用酶联免疫吸附法(Elisa)测定小鼠脑组织中 IL-4、IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ和BDNF的水平,并严格按试剂盒说明书的方法进行测定。

1.3.7 蛋白免疫印迹检测

蛋白免疫印迹检测参考Yang等^[22]的方法并加以修改。使用RIPA裂解缓冲液提取脑组织中的总蛋白,在4 ℃、10 000 r/min的条件下离心20 min。将不同组样品的蛋白质浓度统一后,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并转移至PVDF膜上。在室温下,使用5%脱脂奶溶液对PVDF膜进行1 h的封闭处理。然后将膜与稀释比为 1∶1 000 的特异性一抗[BDNF、CREB、TrkB、phospho-CREB(Ser133)、phospho-TrkB(Tyr817)、α-Tubulin和GAPDH)]在4 ℃的环境中孵育过夜。孵育完成后,用TBST洗涤PVDF膜,并用稀释比为1∶1 000 的HRP-二抗在室温下孵育1 h。再次使用TBST清洗后,使用BeyoECL Moon增强化学发光试剂盒对PVDF膜进行曝光。最后使用凝胶成像分析系统对蛋白质条带进行拍摄,并使用Image J软件进行量化分析。

1.4 数据处理

实验数据以平均值±标准差表示,使用SPSS 23.0软件进行统计学分析,组间数据采用One-way ANOVA中的Duncan进行分析,P<0.05表示数据具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 大豆蛋白和大豆肽对小鼠焦虑样行为的影响

高架十字迷宫是应用最为广泛的焦虑动物模型之一,主要是利用啮齿类动物对敞开环境的恐惧以及对新环境的探究特性之间的矛盾来考察动物的焦虑状态^[23]。本研究对小鼠进行高架十字迷宫行为学实验以评估大豆蛋白和大豆肽对小鼠焦虑样行为的影响。CUMS通过模拟生活中的压力事件来诱发啮齿类动物的焦虑行为,主要用于神经生物学机制研究和药物筛选^[24-25]。图1为大豆蛋白和大豆肽对小鼠焦虑样行为影响的实验结果。由图1(a)和图1(b)可见,CUMS可使小鼠在开臂中的时间和进入开臂的次数占比显著降低,分别为空白组的48.3%和66.2%(P<0.05),表明模型组小鼠产生了焦虑样行为,与Wang等^[26]的研究结果一致。大豆蛋白组小鼠进入开臂的次数占比(39.7%±8.0%)为模型组的1.4倍(P<0.05);大豆肽组小鼠在开臂中的时间占比(21.0%±2.8%)和进入开臂的次数占比(41.2%±4.1%)均显著增加,分别为模型组的2.0倍和1.4倍(P<0.05)。此外,通过图1(c)的轨迹图也可以看出大豆蛋白和大豆肽促进了小鼠在开臂中的活动。研究结果表明,大豆蛋白和大豆肽的营养干预可有效缓解小鼠的焦虑样行为,其中大豆肽效果更佳。

图(a)和图(b)中不同小写字母表示组间数据具有显著差异(P<0.05)。

图1 大豆蛋白和大豆肽对小鼠焦虑样行为的影响

2.2 大豆蛋白和大豆肽对小鼠海马体中小胶质细胞的影响

小胶质细胞作为大脑内固有的免疫细胞,在中枢神经系统的免疫防御中扮演着关键角色^[27]。研究指出,在慢性压力状态下,小胶质细胞介导的中枢神经系统炎症可能促发焦虑和抑郁症状^[27]。为探究大豆蛋白和大豆肽对小胶质细胞的影响,采用免疫组织化学染色技术,对小胶质细胞标记物Iba-1进行定位观察,实验结果见图2。由图2可知,Iba-1阳性细胞呈现棕红色[图2(a)中的红色箭头]。在模型组中,小鼠海马体中的小胶质细胞胞体呈圆形且显著增大,突起短而厚,呈现激活状态,同时在CA1和CA3区也观察到了相同的现象。与模型组相比,大豆蛋白组和大豆肽组中小胶质细胞的胞体恢复正常,激活细胞减少。进一步对Iba-1阳性细胞的数量进行统计,结果见图2(b)至图2(e)。由图2(b)至图2(e)可见,与空白组相比,模型组小鼠的海马区、CA1区和CA3区中Iba-1阳性细胞的数量显著增加(P<0.05),分别增加了110%、51.4%和75%。与模型组相比,大豆蛋白可降低小鼠海马区和CA1区Iba-1阳性细胞的数量,大豆肽可显著降低小鼠海马区、CA1区和CA3区Iba-1阳性细胞的数量,分别下降了39.0%、43.2%和40.8%(P<0.05)。本研究结果表明,大豆蛋白和大豆肽均能抑制小鼠海马体中小胶质细胞的增殖和活化,从而可能对神经炎症具有潜在的改善作用,其中大豆肽的作用更加显著。

图(a)中红色箭头表示Iba-1阳性细胞。不同小写字母表示组间数据具有显著差异(P<0.05)。

图2 大豆蛋白和大豆肽对小鼠海马体中小胶质细胞数量的影响

2.3 大豆蛋白和大豆肽对小鼠脑组织中炎症因子的影响

小胶质细胞在活化状态下会释放多种炎症细胞因子,进而引发神经炎症^[28]。为了探究大豆蛋白和大豆肽对小鼠脑组织中神经炎症的影响,分别对抑炎因子(IL-4、IL-10)和促炎因子(IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ)进行了测定,实验结果见图3。由图3可见,模型组小鼠脑组织中抑炎因子IL-4和IL-10的水平下降,促炎因子IL-6的水平上升,IL-1β的水平显著上升(P<0.05),从而引起轻度神经炎症。与模型组相比,大豆蛋白组IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的水平显著降低(P<0.05),分别降低了21.5%、34.2%、10.9%和32.5%,表明大豆蛋白可以抑制促炎因子的表达,从而减轻神经炎症。另外,大豆肽组中抑炎因子IL-10的水平提高至(17.5±2.3) ng/mL,与模型组相比显著提高了23.3%(P<0.05)。同时大豆肽组中的促炎因子IL-1β和TNF-α的水平分别降低至(1.3±0.3) ng/mL和(378.6±31.2) pg/mL,与模型组相比显著降低了26.8%和13.7%(P<0.05),这表明大豆肽可调节促炎因子和抑炎因子的水平,从而缓解神经炎症。综上所述,大豆蛋白和大豆肽均可有效抑制促炎因子的表达,同时大豆肽可有效促进抑炎因子的表达,从而减轻小鼠的神经炎症,并缓解由此引发的焦虑症状,此结果与2.2中小鼠海马体中小胶质细胞激活的结果一致。现有研究已经证明了大豆肽的抗炎活性。Yi等^[29]通过脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症,发现大豆肽可以抑制促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的释放,而且大豆肽易消化吸收,可提高炎症应激的速度。Zhang等^[30]通过造模老龄大鼠烧伤模型诱导炎症反应,发现相较于大豆蛋白,大豆肽可显著降低血清IL-β和TNF-α的水平,从而减轻炎症反应。本研究通过CUMS造模焦虑小鼠,发现大豆肽可显著提高IL-10的水平,显著降低IL-1β和TNF-α的水平,抑制CUMS诱导的神经炎症,从而发挥抗焦虑作用。

不同小写字母表示组间数据具有显著差异(P<0.05)。

图3 大豆蛋白和大豆肽对小鼠脑组织中炎症因子的影响

2.4 大豆蛋白和大豆肽对小鼠脑组织中脑源性神经营养因子的影响

BDNF作为神经营养因子家族的重要成员,可以促进神经元的生成、存活和分化,从而缓解焦虑症^[31]。本研究同时进行了大豆蛋白和大豆肽对小鼠BDNF水平影响的探讨,以评估二者对神经营养功能的潜在调节作用,实验结果见图4。由图4可知:模型组小鼠脑组织中BDNF的水平降低至(29.1±4.1) ng/mL,与空白组相比显著降低了20.9%(P<0.05);大豆蛋白组和大豆肽组BDNF的水平分别提高至(31.9±6.0) ng/mL和(35.5±3.2) ng/mL,与模型组相比分别显著提高了9.9%和22.0%(P<0.05),其中大豆肽组恢复至与空白组相同的水平。研究结果表明,大豆肽可提高BDNF的水平,增强神经营养功能,从而发挥抗焦虑作用。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图4 大豆蛋白和大豆肽对小鼠脑组织BDNF水平的影响

2.5 大豆蛋白和大豆肽对小鼠脑组织中BDNF-TrkB-CREB信号通路的影响

BDNF-TrkB-CREB已成为焦虑等情绪障碍研究的关键信号通路^[32]。在该通路中,BDNF与其下游受体TrkB结合,诱导酪氨酸磷酸化,进而激活ERK/CREB通路,使其转录生成pro-BDNF mRNA,经过翻译后生成pro-BDNF,最终生成BDNF^[33]。为进一步探究大豆蛋白和大豆肽通过调节BDNF发挥抗焦虑作用的机制,测定了BDNF-TrkB-CREB信号通路中BDNF、TrkB、CREB、p-TrkB和p-CREB蛋白的表达,实验结果见图5。由图5可知:与空白组相比,模型组小鼠脑组织中BDNF、p-TrkB和p-CREB的表达分别显著降低了27.2%、33.5%和28.2%(P<0.05),这表明CUMS可抑制BDNF-TrkB-CREB通路,减少BDNF的产生,从而导致小鼠产生焦虑样行为;与模型组相比,大豆蛋白组小鼠脑组织中BDNF的表达提高了39.8%(P<0.05),大豆肽组BDNF和p-TrkB的表达显著上升,分别提高了63.0%和42.5%(P<0.05)。Zhu等^[34]研究发现,乳清蛋白水解物和色氨酸寡肽可提高BDNF、TrkB和CREB的mRNA表达,促进BDNF/TrkB信号转导,从而缓解小鼠的焦虑抑郁行为。本研究中采用CUMS诱导焦虑小鼠,发现大豆蛋白和大豆肽均可通过作用于BDNF-TrkB-CREB通路生成 BDNF,其中大豆肽可进一步诱导TrkB的磷酸化,激活下游通路,产生更多的BDNF从而发挥抗焦虑作用。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图5 大豆蛋白和大豆肽对小鼠脑组织BDNF-TrkB-CREB信号通路蛋白表达的影响

3 结 论

本研究评估了大豆蛋白和大豆肽营养干预对CUMS诱导焦虑样行为小鼠的影响,涉及行为学表现、小胶质细胞状态、炎症因子、BDNF水平及BDNF-TrkB-CREB通路上的蛋白表达。研究结果表明,大豆蛋白和大豆肽均能缓解小鼠的焦虑样行为,其中大豆肽可显著增加小鼠在开臂中的时间和进入开臂的次数,从而抑制小胶质细胞的激活,表现出较强的抗焦虑活性。进一步研究发现,大豆蛋白显著降低了IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平,大豆肽显著降低了IL-1β、TNF-α的水平并显著提升了IL-10的水平。大豆蛋白可有效抑制促炎因子的表达,而大豆肽在促进抑炎因子表达方面表现更为显著,从而减轻了小鼠的神经炎症。另外,大豆蛋白可显著上调BDNF的蛋白表达,大豆肽可显著上调BDNF的水平、BDNF和p-TrkB蛋白的表达,可以促进BDNF-TrkB-CREB通路的信号传导,进而增强神经营养功能。与大豆蛋白相比,大豆肽在提高抑炎因子和BDNF水平方面的效果更加显著,因而展现出更强的抗焦虑效果。希望本研究可为大豆肽相关功能性食品的开发提供理论支持,并为营养干预辅助治疗焦虑症提供新的思路。未来将对大豆肽中发挥作用的关键肽段及其抗焦虑机制进行深入探究。