江南大学未来食品科学中心和生物工程学院陈坚院士团队周景文教授课题组：工程化提高新型醛脱氢酶的热稳定性和催化活性

成果介绍

在当前的乙醛酰化脱氢酶(ADA)研究中，催化效率低和热稳定性差是亟待解决的两大问题。首先，现有的DpADA(来源于Dickeya parazeae)在催化乙醛转化为乙酰辅酶A的过程中表现出较低的催化效率，导致传统酶催化剂无法工业环境中有效使用，进而限制了其在环境治理和生物催化过程中的应用潜力。其次，虽然现有的酶筛选方法通常依赖于序列相似性或催化机制的推断，这些方法具有一定的局限性，往往无法从庞大的酶数据库中筛选出具有增强催化活性的酶变体。缺乏有效的筛选手段使得传统方法未能充分挖掘醛脱氢酶的潜力，进一步限制了酶的应用范围。深度学习(DL)和Kcat预测等计算工具尽管在酶工程领域取得了一些成功，但这些方法通常基于经验模型，难以全面捕捉酶催化反应中的所有物理相互作用。这些工具在准确预测催化效率和优化酶性能时仍存在一定不足，亟需更加精确的优化策略。

针对上述问题，研究团队采取了多项创新措施，以提升醛脱氢酶的催化效率和热稳定性。首先，结合深度学习和虚拟筛选技术，研究人员采用DLKcat和Kcat orediction模型，从5000个与DpADA同源的酶变体库中筛选出潜力变体，成功发现来自Buttiauxella sp. S04−F03的ADA6变体，该变体表现出比DpADA高14.1倍的催化活性，能够将57.6%的乙醛转化为乙酰辅酶A，显著提高了催化效率。为了克服热稳定性差的问题，通过分子动力学模拟和折叠工程对ADA6进行优化，开发了P443C突变体，成功将其在60°C下的残余活性提高了80.7%。此外，又对酶的底物通道进行了优化，采用双重评分机制改进了酶的催化性能，设计出P443C-I440T突变体，该变体在催化乙醛时展现出93.2%的转化率，显著提高了催化效率并解决了传统酶催化过程中存在的空间障碍问题。最后，通过量子计算分析，发现Cys271在催化过程中发挥关键作用，通过优化该位点，进一步提升了催化效率。优化后的ADA6-P443C-I440T变体显著提高了催化效率和热稳定性，能够高效催化乙醛转化为乙酰辅酶A，展现了其在工业催化和环境治理中的巨大潜力。通过结合深度学习、分子动力学模拟、量子计算和理性突变等多种创新手段，研究团队不仅提升了醛脱氢酶的催化效率和热稳定性，还为酶催化剂的优化和设计提供了重要参考，为酶催化技术的应用奠定了坚实的基础，并为实际生产和环境保护提供了高效、可持续的生物催化剂。

上述研究工作得到了国家重点研发计划(2019YFA0904900)、江苏省自然科学基金前沿引领技术基础研究专项(BK20202002)、浙江大学上海高等研究院繁星科学基金(SN-ZJU-SIAS-0013)、中国博士后科学基金(2023M741403)、江苏省卓越博士后计划(2023ZB037)和双一流学科与支撑学科协同发展支持计划(QGJC20230102)等项目的资助。