西农葡萄种质资源与育种团队利用全基因组测序揭示CRISPR / Cas9在葡萄上的脱靶效应

       近日，Horticulture Research在线发表了西北农林科技大学葡萄种质资源与育种团队王西平课题组题为“Whole genome sequencing reveals rare off-target mutations in CRISPR/Cas9-edited grapevine”的研究论文。青年教师王现行与涂明星博士为该文第一作者，王西平教授为通讯作者。

        该研究对3株野生型（WT）与7株Cas9突变葡萄株系进行了全基因组测序分析（Fig. 1）。与3株野生型相比，在7株Cas9突变葡萄株系中鉴定出202,008至272,397个单核苷酸突变（SNP），以及26,391至55,414个插入/缺失突变（indels）。随后，利用在全基因组范围鉴定到的3,272个潜在脱靶位点进行下一步深入分析。最终，仅发现一个脱靶的突变（indel），并利用Sanger测序证实。另外，研究人员分析了转基因所用无核白基因组与葡萄参考基因组（PN40024）之间的遗传变异，发现了243个新的潜在脱靶位点，随后进一步在7个突变材料中进行验证，最终并没有发现真正的脱靶位点。以上结果表明，CRISPR / Cas9在葡萄上具有高特异性，在葡萄抗逆基因的发掘及分子育种上具有重要的应用价值。

        葡萄在世界范围内广泛种植，是重要的经济果树之一。然而，每年受生物与非生物胁迫影响损失巨大，培育优质、抗逆的葡萄新品种具有重要的现实意义。生物技术育种可以极大地缩短育种周期，具有重要的应用价值，而相关育种技术的缺乏限制了葡萄分子育种的进程。近年来，CRISPR/Cas9技术发展迅速，团队前期已经成功在葡萄上建立了高效的CRISPR/Cas9基因编辑体系，证明了CRISPR/Cas9技术可以在葡萄上实现单个或多个基因的打靶以及精确的大片段敲除，这为葡萄抗逆基因的发掘及分子育种提供了重要的技术手段（Plant Biotechnology journal，2018，16：844-855）。然而，潜在的脱靶风险影响CRISPR/Cas9技术在葡萄上的广泛应用，因此评估其在葡萄上的脱靶效应，具有重要的理论和实践意义。

        该研究得到了国家自然科学基金（U1603234、31572110、32002000）和葡萄种质资源与育种应用创新团队项目（2013KCT-25）的资助。