南京农大作物疫病团队首次建立了CRISPR系统介导的腐霉菌基因敲除和原位回补等技术,揭示RNA结合蛋白调控卵菌有性发育的分子机制

       卵菌包括疫霉、腐霉、霜霉、白锈和水霉等重要病原菌，是许多植物、动物乃至人类病害的“元凶”。有性生殖产生卵孢子是卵菌独特的生物学过程，厚壁的卵孢子使其能够在土壤等不良环境与条件中存活数年，成为卵菌病害难以被彻底根治的重要症结。腐霉菌普遍具有极强的环境与寄主适应性；其中，终极腐霉（Pythium ultimum）位列十大病原卵菌，可引致大豆、玉米和小麦等300多种植物的枯萎或根腐病[2]。有趣的是，田间主流的、致病力较强的一类终极腐霉（P. ultimum var. ultimum）未被发现能够产生无性的游动孢子，因而有性阶段形成大量卵孢子对于其侵染循环更显重要。

        近日，南京农业大学作物疫病团队在国际知名期刊《PLoS Pathogens》在线发表了题为“Specific interaction of an RNA-binding protein with the 3′-UTR of its target mRNA is critical to oomycete sexual reproduction”的研究论文[1]。该研究首次建立了CRISPR/Cas9系统介导的腐霉菌基因敲除和原位回补等遗传操作技术，并揭示了一个RNA结合蛋白通过结合其靶标mRNA的3′-UTR来调控腐霉菌有性发育的分子机制。 

        该研究首先通过转录组分析发现了终极腐霉卵孢子形成阶段特异表达的PuM90基因（编码Puf家族RNA结合蛋白），敲除该基因后，突变体卵孢子壁变薄，发育缺陷。随后结合比较转录组分析和靶标序列预测，经筛选与验证后，发现PuM90的RNA结合域可以特异地结合PuFLP（编码flavodoxin-like蛋白）mRNA 3’-UTR的motif，从而降低PuFLP 的mRNA丰度，促进卵孢子正常发育。该研究建立了一套完整的腐霉菌的基因功能研究技术体系，鉴定了两个参与卵孢子形成的关键基因，并揭示了Puf家族RNA结合蛋白在转录后水平调控下游关键基因的新机制。

        根腐病病原种类复杂，经常由多种病原菌复合侵染，是全世界农业生产中的难题。在大豆上，引致根腐病的病原菌除了大豆疫霉和立枯丝核菌，还有腐霉属和镰孢属的多种病原菌[3-4]。该团队近年来在我国黄淮海等大豆主产区开展根腐病调查，鉴定了终极腐霉在内的32种腐霉菌（包括新种）[5-6]，并利用比较基因组学挖掘新靶标，建立了重要腐霉菌的LAMP检测技术[7-8]。该最新研究进展深入揭示了腐霉菌侵染循环中的关键调节因子与作用机制，为新药剂研发提供了候选靶标与理论依据。

        南京农业大学植物保护学院叶文武副教授为该论文的通讯作者，博士研究生冯慧为第一作者，郑小波教授、王源超教授、董莎萌教授和窦道龙教授也参与了该项研究工作。该研究得到了国家自然科学基金和国家大豆产业技术体系等项目的资助。
 

相关文献：

[1] Feng, et al. Specific interaction of an RNA-binding protein with the 3′-UTR of its target mRNA is critical to oomycete sexual reproduction. PLoS Pathogens, 2021, Oct 14.

[2] Kamoun, et al. The Top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology, 2015, 16: 413-434.

[3] 叶文武 等. 大豆根腐病监测与防控关键技术研究进展. 大豆科学, 2020, 39(5): 804-809.

[4] Ye, et al. A LAMP-assay-based specific microbiota analysis reveals community dynamics and potential interactions of 13 major soybean root pathogens. Journal of Integrative Agriculture, 2020, 19(8): 2056-2063.

[5] Feng, et al. Pathogenicity and fungicide sensitivity of Pythium and Phytopythium spp. associated with soybean in the Huang-Huai region of China. Plant Pathology, 2020, 69, 1083-1092.

[6] Chen, et al. Pythium huanghuaiense sp. nov. isolated from soybean: morphology, molecular phylogeny and pathogenicity. Biodiversity Data Journal, 2021, 9: e65227.

[7] Feng, et al. A loop-mediated isothermal amplification assay can rapidly diagnose soybean root-rot and damping-off diseases caused by Pythium spinosum. Australasian Plant Pathology, 2019, 48, 553-562.

[8] Feng, et al. Development of LAMP assays using a novel target gene for specific detection of Pythium terrestris, Pythium spinosum, and "Candidatus Pythium huanghuaiense". Plant Disease, 2021, Apr 6.