JIPB | 潍坊现代农业山东省实验室/北京大学现代农业研究院邓兴旺实验室李健课题组/张华伟实验室构建小麦新型高效基因编辑体系

图1. 小麦新型高效基因编辑体系模式图

研究人员关注到基因编辑产生的平末端双链断裂（DSBs）在体内容易被直接连接恢复成野生型序列，降低编辑效率。已有研究报道共表达Cas9蛋白和核酸外切酶，如Trex2和I-SceI，可以显著提高基因编辑效率。在这项研究中，研究人员设计了三种基因编辑载体，比较Cas9、通过自剪切肽段共表达的Trex2-P2A-Cas9和Cas9-Trex2融合蛋白在六倍体小麦中的编辑效率，发现共表达Cas9和Trex2可以提高编辑效率，而Cas9-Trex2融合蛋白在单基因和多基因编辑中均取得了最高的编辑效率。在转基因T₀代小麦中，含有Cas9-Trex2融合蛋白的pCas9T载体在六倍体小麦中实现了高达44.3%-94.7%的单基因敲除效率，并且获得了高达12.9%-26.3%的三基因纯合/双等位突变率。此外，pCas9T系统具有低基因型依赖性，在不同的小麦品种中（春小麦Fielder和冬小麦SN48）中都能保持高效的基因编辑能力。pCas9T主要导致5-25 bp的缺失，而pCas9主要产生单碱基插入和1-3 bp的缺失。值得一提的是， pCas9T系统展现出超强的一代多基因编辑潜力。作者通过构建一个包含三个sgRNA表达盒的载体同时编辑了九个基因位点，在25株T₀代转基因小麦中，76%的植株在所有九个目标位点上发生了突变，36%的植株在九个目标位点上均为纯合/双等位基因突变。

图2. 利用Cas9-Trex2融合蛋白构建高效小麦基因编辑体系

文章引用：

Pan W., Gao C., Niu D., Cheng J., Zhang J., Yan X., Long Q., Zhu Y., Sun W., Xie Q., He Y., Deng X.W., Zhang H., Li J. (2024), Efficient gene disruption in polyploid genome by Cas9-Trex2 fusion protein. J. Integr. Plant Biol. http://doi.org/10.1111/jipb.13797